他一边考察，一边治病救人。曾经有位老婆婆，患习惯性便秘三十余年，苦不堪言。李时珍运用民间偏方，药到病除。还有位农妇鼻腔出血昼夜不止，李时珍巧妙地用大蒜切片敷贴足心，很快帮她止住了鼻血。
他的医术越来越精深，名气也越来越大，终于“来章，有庆誉，吉。”公元1556年，李时珍被推荐入朝，到太医院担任太医院判。
嘉靖帝朱厚熜酷爱炼制仙丹，追求长生不老，因此在全国掀起了一股炼丹热。当时不少人因服用仙丹中毒死亡。李时珍知道仙丹多含水银、铅、丹砂、硫磺等成分，于是呼吁朝野上下不要迷信丹药长寿的说法。他虽然坚决反对服食仙丹，却以科学的态度看待炼丹术。他通过研究，总结出了用水银医治皮肤病以及用炼金术烧制外用药物的方法。
在太医院的工作经历，使他获益匪浅，为他编着《本草纲目》带来了积极的影响。
他有机会出入太医院的皇家药房及御药库，看到许多平时难得一见的贵重药材，深入了解其性状、形态和产地。同时，他能够广泛阅读皇家书库珍藏的各类医药典籍，使得眼界更加开阔，医学知识更加丰富。
他在太医院任职一年后，托病辞职返乡，在老家创立东璧堂，一边坐堂行医，悬壶济世，一边继续考察研究各类药物，编制本草之书。
公元1578年，此时已是明神宗万历年间，李时珍历时二十七年，终于完成《本草纲目》初稿。此后又经十余年三次修改，终成其书。这部伟大着作吸收了历代本草着作的精华，增益其所不足，“丰其屋，蔀其家，”是十六世纪以前中国最系统、最完整、最科学的医药学着作。
该书凡十六部五十二卷一百九十余万字，共辑录中医药单方则，收录本草1892种。其中含植物1195种，并附药物形态图1100余幅。
李时珍打破了自《神农本草经》以来的上、中、下三品分类法，开创性地把药物分为水、火、土、金石、草、谷、莱、果、木、器服、虫、鳞、介、禽、兽、人共十六部六十类。在书中分纲列目，系统清晰地记录了各种药物的历史、形态、功能和方剂应用等知识。这种按药物自然属性逐级分类的纲目体系，是现代生物分类学的重要方法。